Ταχεία ανίχνευση ωχρατοξινογόνων μυκήτων σε σταφύλια

Amplification-plot.jpg
Οι μύκητες του γένους Aspergillus, ιδιαίτερα αυτοί που ανήκουν στο τμήμα Nigri και περιγράφονται ως μαύροι Ασπέργιλλοι, είναι υπεύθυνοι σε μεγάλο βαθμό για την επιμόλυνση επιτραπέζιων και οινοποιήσιμων ποικιλιών σταφυλιών με ωχρατοξίνη A (OTA). Το είδος Aspergillus carbonarius θεωρείται το πιο ισχυρό μεταξύ των άλλων ασπεργίλλων ως προς την παραγωγή ΟΤΑ. Για την παρακολούθηση της μόλυνσης και την πρόληψη της εισόδου της τοξίνης στην τροφική αλυσίδα είναι πολύ σημαντικό να υπάρχει μια γρήγορη και εξειδικευμένη μέθοδος, η οποία θα μπορεί να ανιχνεύσει και να ποσοτικοποιεί πιθανά OTA-παραγωγά είδη μυκήτων στο αρχικό στάδιο της μόλυνσης. Η ανίχνευση αυτών των μυκήτων στα σταφύλια είναι ιδιαίτερα κρίσιμη κατά την περίοδο συγκομιδής, όταν ο κίνδυνος της μόλυνσης και της παραγωγής OTA θεωρείται αυξημένος.
Οι συμβατικές τεχνικές καλλιέργειας χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση αυτών των μυκήτων εδώ και πολλά χρόνια. Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι είναι χρονοβόρες και συχνά δεν είναι σε θέση να δώσουν ακριβή αποτελέσματα για την αναγνώριση των μυκήτων. Ο χαρακτηρισμός των μαύρων Ασπέργιλλων με βάση μορφολογικά χαρακτηριστικά μπορεί να αποδειχθεί δύσκολο έργο, συνήθως απαιτεί αρκετή εμπειρία από τον αναλυτή και ο υπολογισμός του φορτίου του μύκητα (ποσοτικοποίηση) μπορεί να είναι μεροληπτικός, λόγω των διαφορετικών ρυθμών αύξησης μεταξύ των διαφορετικών ειδών μυκήτων στα σταφύλια.
Η ανάπτυξη και η εξέλιξη των τεχνικών μοριακής βιολογίας, όπως για παράδειγμα η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού-χρόνου (real-timePCR), έχουν συμβάλει στη δημιουργία νέων προσεγγίσεων για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των μυκήτων σε τρόφιμα, μέσω της ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης του DNA τους. Οι τεχνικές PCR αποτελούν αξιόπιστες και γρήγορες εναλλακτικές λύσεις σε σχέση με συμβατικές τεχνικές για την ανίχνευση εν δυνάμει τοξινογόνων μυκήτων. Και οι δύο τεχνικές βασίζονται στην επιλεκτική ενίσχυση των αλληλουχιών DNA που μπορούν να χρησιμεύσουν ως ειδικοί μοριακοί δείκτες για ένα είδος.
Η συμβατική PCR (endpointPCR) χρησιμοποιείται για ανίχνευση των μυκήτων σε ένα δείγμα τροφίμου ή σύμπλοκο υπόστρωμα ανάπτυξης και μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλες τεχνικές, όπως η ανάλυση πολυμορφισμού θραυσμάτων DNAμετά απο ενζυματική πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες (RestrictionFragmentLengthPolymorphism), και η αποκωδικοποίηση της αλληλουχίας DNAπολλαπλών σημείων του γενώματος, για τον χαρακτηρισμό ένα είδος μύκητα. Η Real-time PCR (ποσοτική PCR) επιτρέπει την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των ειδών-στόχων σε ένα δείγμα τροφίμου, και η παρακολούθηση των αποτελεσμάτων μπορεί να γίνει σε πραγματικό χρόνο. Η αρχή λειτουργίας και οι τύποι real-time PCR (SYBR Green, TaqMan) προσδίδουν μεγαλύτερη εξειδίκευση και ευαισθησία σε σχέση με τη συμβατική PCR. Επιπλέον η ποσοτική PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μελέτη της έκφρασης επιλεγμένων γονιδιακών στόχων. Και οι δύο τεχνικές προσφέρουν τη δυνατότητα για multiplex λειτουργία, επιτρέποντας την ταυτόχρονη ενίσχυση περισσοτέρων της μίας αλληλουχίας στόχου σε μία μόνο αντίδραση.
Κάτω από το πλαίσιο παρακολούθησης και πρόβλεψης της μόλυνσης σταφυλιών από ωχρατοξινογόνους μύκητες, έχει αναπτυχθεί ένας σημαντικός αριθμός μεθόδων endpointκαι realtimePCRγια την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό διαφόρων ειδών AspergillusκαιPenicillium. Ειδικά για την ανίχνευση-ποσοτικοποίηση του μύκητα Α. carbonarius, έχουν αναπτυχθεί μέχρι σήμερα μέθοδοι endpointPCRκαθώς και μέθοδοι realtimePCR, που χρησιμοποιούν ως στόχους διαφορετικές περιοχές του γενώματος του μύκητα οι οποίες δεν σχετίζονται απαραίτητα με γονίδια που συμετέχουν στη βιοσύνθεση της ωχρατοξίνης ή αποτελούν δείκτες της παραγωγή της.

Το έργο «Σχεδιασμός και ανάπτυξη καινοτόμων εργαλείων για την ανίχνευση ωχρατοξινογόνων μυκήτων σε οινοποιήσιμα και επιτραπέζια σταφύλια - FungalPrognosis_242» υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Πρόγραμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους, στο πλαίσιο της δράσης ΑΡΙΣΤΕΙΑ-Ι.

Επιστροφή Επάνω